美国华盛顿大学David Baker研究组在Science发文题为Reconfigurable asymmetric protein assemblies through implicit negative design，实现不对称蛋白质的快速、定向设计。

作者们试图进行的异质性二聚体设计思路是促进单个组分在混合时自发组装，可以进行动态交换且能够进行刚性融合（Rigid fusion），从而实现的特定结构的高阶异质性蛋白质的组装。任何脱靶的相互作用需要付出很高的热力学能量，导致脱靶的代价更大，从而降低非预期低聚化发生的概率。这里所提到刚性融合与可自由移动连接序列（Flexible linker）相对应。自由移动连接序列通常是由柔性的氨基酸所组成，当我们将目的蛋白与较大的例如荧光蛋白等连接在一起构建融合蛋白的时候，我们会加入连接序列确保两部分蛋白能够分别正确折叠。而刚性融合则是按照一定程序组装而成的具有明确界定的复合体，具有独特的整体形状，这一特征对其功能也直观重要。

可重构不对称蛋白质可以采用能够进行相互作用的不同模块，这对于单个模块要求是，这些亚基能够稳定且独立存在，因此可以很容易地从但蛋白质异质性聚合体中被添加和移除；其次，这些模块之间的相互作用是特定的；第三，就是先前提到的这些模块能够进行刚性融合。

作者们首先希望提高单体的性能，因为蛋白质单体本身具有灵活性和不稳定性，会在一定范围内形成非预期的同源物，所以通过引入隐性负设计的方式降低自由能、提高单体疏水性、构建具有一定特征的相互作用界面，从而提高单体与单体之间结合的特异性（图2）。

图2 不对称蛋白质设计的步骤

作者们进行了238个单体的被测设计，其中有71个通过分子筛，是可以进行单体表达的基因。这其中又有32个可以形成异质性的二聚体。这些就是就类似于在体外进行蛋白质设计的“积木”（图3）。另外，作者们也对这些异质性二聚体的动力学特征进行刻画，并对其中一些组分的晶体结构进行检测。所生成的刚性融合蛋白既能够保持低聚化的状态，又能够保持结合活性，说明从头设计的这些异质性二聚体的融合相当稳健。

图3 高阶多聚体的设计

随后对不对称多聚体结构组装进行了进一步优化。首先，作者们有“积木”在手情况下，试图构建线性的多聚体结构，因此加入了连接体（Connector）因素，这样可以确保这些积木按照所需要的连接方向构建形成蛋白质组装。随后又进行了分支结构和封闭结构的构建尝试与检测。作者们通过所得到的积木组装了三价、四价连接体结构，从而可以实现更为复杂的蛋白质结构。连接体结构类似于多头充电器，因此可以用于搭建多支结构（图4）。

图4 不同形状的多价连接体

在构建完成这些体外结构后，作者们对构建的蛋白质生物活性进行了检测，由于中间加入了荧光蛋白，所以作者们可以对这些蛋白质在细胞中的表达与定位直接进行观测。另外由于多价作用位点的存在，所以会在细胞中产生液-液相分离的液滴，从而确认了所构建体外组装体的活性。

总的来说，作者们的工作通过刚性融合的方式进行不对称蛋白组装体的构建，实现了更为快速也更加定向化的蛋白质设计。蛋白质设计师的奇思妙想正在逐步实现和推广，像堆积木一样信手拈来的蛋白质生物合成的愿景在路上啦！

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.abj7662